一、实验原理

凝胶层析又称排阻层析、分子筛层析和凝胶过滤。凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质，其内部具有很细微的多孔网状结构。凝胶层析的机理是分子筛效应。凝胶颗粒在合适溶剂中浸泡，充分吸液膨胀，然后装入层析柱内，加入欲分离的混合物后，再以同一溶剂洗脱。在洗脱过程中大分子不能进入凝胶内部而沿凝胶颗粒间的空隙先流出柱外，而小分子可以进入凝胶颗粒内部的多孔网状结构，流速缓慢，以致后流出柱外，从而使样品中分子大小不同的物质按顺序分离开。

目前使用的凝胶有葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶和琼脂糖与葡聚糖组成的复合凝胶。本实验用的是葡聚糖凝胶，是由多聚葡萄糖与环氧化氯丙烷通过交联反应制成的有孔颗粒状凝胶。

根据凝胶层析的原理，对同一类型化合物，其洗脱特征与组分的相对分子质量有关，流过凝胶柱时，按分子大小顺序流出，相对分子质量大者走在前面。通常以对相对分子质量的对数作图可得一曲线，称“选择曲线”，曲线斜率是凝胶性质的一个重要特征，在一定范围内，曲线愈陡分级愈好。在测定末知物的相对分子质量时，以使用曲线的直线部分为宜。

二、实验用品

（一）器材

（1）层析柱：1.1×100cm。

（2）核酸蛋白质检测仪或紫外分光光度计。

（3）自动部分收集器，恒压瓶，口瓶。

（二）试剂  

（1）Sephadex G-75。

（2）5% Ba(AC)₂。   

（3)洗脱液：0.025mol/L　Kcl０.２ｍｏｌ／Ｌ　乙酸溶液。

（4）蓝色葡聚糖－２０００（２mｇ／ｍｌ）。

（5）Ｎ－乙酰酪氨乙酯（１～２ｍｇ／ｍｌ）。

（6）标准蛋白质混合液（各２～３mg／ｍｌ，用Kcl－乙酸溶液配制）；包括牛血清白蛋白，鸡卵清蛋白，胰凝乳蛋白酶原和结晶牛胰岛素，均需层析纯。

（三）材料

牛血清白蛋白，鸡卵清蛋白，胰凝乳蛋白原A，结晶牛胰岛素，以上材料均需层析纯。

三、实验程序

（一）操作方法

 1.一般操作方法

（１）凝胶的选择和处理：凝胶颗粒大小均匀。对于颗粒不均匀的凝胶，可将其悬浮于大体积的水中，让其自然沉降，在一定时间之后，用倾泻法除去悬浮的过细颗粒。

将称好的凝胶干粉倾入过量的洗脱液中，室温下放置，使之充分溶胀。注意不要过分搅拌，以防颗粒破碎。溶胀时间因凝胶交联度不同而异。为了缩短溶胀时间，杀死细菌和霉菌，排除凝胶内气泡，可在沸水浴上加热。