碱性磷酸酶的分离提取及比活力的测定

一、实验原理

       碱性磷酸酶（alkaline phosphatase   EC 3.1.3.1简称为ALPase）广泛存于微生物界和动物界。ALPase能催化几乎所有的磷酸单酯的水解反应，产生无机磷酸和相应的醇、酚或糖。它也可以催化磷酸基团的转移反应，磷酸基团从磷酸酯转移到醇、酚或糖等磷酸受体上。在磷的生物和化学循环过程中，ALPase起了及其重要的作用。在生物体内ALPase与磷的代谢直接相关，参与磷与钙物质的消化、吸收、分泌以及骨骼的形成等生理生化过程。ALPase的作用zui适PH在碱性区域，一般在PH9.0~10.5范围内。Mg2+对该酶的活力有显著的激活使用。

       为了获得好的提取效果，在酶的制备过程，特别应注意以下几点：

       1.选取来源丰富、酶含量高的新鲜材料。提取工作应在获得材料后立刻开始，否则应在低温下保存。

       2.用盐分级沉淀是一种应用非常广泛的方法。碳酸铵是zui常用的盐。操作时，要注意保持缓冲液的合适PH值和温度。在加碳酸铵时需事先将其研细，需缓慢加入并及时搅拌溶解，尽量防止泡沫形成，以免酶蛋白在溶液中表面变性。盐析生成的沉淀，要静置20min以上，以使沉淀*，然后方可时行离心分离。

      3.有机溶剂沉淀法也常用于蛋白质的分离提纯。丙酮和乙醇是使用的两种有机溶剂。应注意在低温下操作，缓慢加入，充分搅拌，避免局部浓度过高放出大量热量而使酶蛋白变性。离心收集沉淀后，立即将其溶于适量缓冲液中，以避免酶活力的丧失。

       4.在酶的制备过程中，每经一步处理，都需测定酶的活力和比活力。唯有比活力提高较大，提纯步聚才有效。

        酶活力的分析：通常是以对—硝基苯磷酸二纳（pNPP)为底物，在PH10.1的碳酸盐缓冲液（含2mmol/L Mg2+）的测活体系中检测酶催化pNPP水解产生黄色的对硝基苯（ pNP）在405 nm处有zui大的吸收峰，可以根据OD4〇5值的增加计算酶活力的大小。酶活力定义为在37℃下，以5mmol/L pNPP为底物，在pH 10.1的碳酸盐缓冲液含2 mmol/L  Mg2+的测活体系中每分钟催化产生1 mol/L pNP的酶量定为1个酶活力单位。酶的比活力定义为每mg蛋白所具有的酶活力单位数。 

       蛋白质浓度的测定常采用福林-酚试剂(Folin-Phenolreagem)显色法。

二、实验用品

(一)器材

    (1) 髙速组织捣粹机和玻璃匀浆器。

    (2) 离心机。

    (3) 超级恒温水浴锅。

    (4) 酸度计。

    (5) 722分光光度计。

    (6)天平、台秤。

    (7)透析袋。

    (8)磁力搅拌器。

    (9)冰箱。

    (10)秒表。

    (11)50µL微量进样器。

  （二）试剂

     (1)含0.1mol/L NaCl 的0.01mol/L Tris.HCL PH7.5缓冲液：称取三羟甲基氨基甲烷1.214g，NaCl5.8g，溶于蒸馏水中，加入80ml 0.1mol/L HCL，用蒸馏水定容到1000ml。

     (2)正丁醇（分析纯）。

     (3) 硫酸铵(分析纯)。

     (4) 0.5% NaCl：称取 5 g NaCl 溶于1000 mL蒸馏水中。

     (5) 0.1 mol/L Na2C〇3-NaHC〇3  pH 10.1 缓冲液:分别取(A)液 70mL，（B)液30ml混匀，用酸度计准确调节pH 10.1。

           (A) 0.1 mol/L Na2C〇3溶液：取 28.6 g Na2C〇3.10H20溶于1000 mL蒸馏水中 。    

           (B) 0.1 mol/L NaHC〇3 溶液：取 8.4 g NaHC〇3 溶于1000 mL蒸馏水中。

     (6) 0.5 mol/L醋酸镁溶液：称取醋酸镁107.25 g溶于蒸馏水中，稀释成1000ml。

     (7) 0.1 mol/L醋酸钠溶液：称取醋酸钠8.2 g溶于蒸馏水中,稀释至1000 ml。

     (8) 0.01 mol/L醋酸镁-0.01 mol/L醋酸钠溶液：取0.5 mol/L醋酸镁20ml醋酸钠100 mL，混匀后加蒸馏水稀释至1000 mL。 

      (9) PH8.8 Tris.HCl缓冲液：称取三羟甲基氨基甲烷(Tris)12.1 g，用蒸馏水溶解。并稀释至1000ml，即为0.1 mol/L Tris溶液。取0.1 mol/L Tris 溶液100mL，加蒸馏水约800ml，再加0.1 mol/L醋酸镁100 mL，混勻后用1 %醋酸调节pH至8.8,用蒸馏水稀释至1000ml即可。

    (10) 丙酮(分析纯)。

    (11) 95%乙醇(分析纯)。

    (12) 20 mmol/L Mgcl2：称取 1.904 g Mgcl2溶于1000ml蒸馏水中。 

    (13) 0.1 mol/L NaOH：称取 4 g NaOH 溶于1000ml蒸馏水中。 

    (14)  20 mmol/L 对硝基苯磷酸二钠（pNPP):称取371.2 mg pNPP溶于50ml蒸馏水中。

    (15) 底物溶液(5mmol/L pNPP)：按以下比例混句(5):(6):(8):H2O=l:0.2：0.50:.28。 

    (16)0.5µmol/mL对硝基苯酚（pNP=141.1)溶液:称取17.64mg对硝基苯酚，用蒸馏水溶解并定容至250 mL。

    (17) Folin甲。

    (18) Folin乙 。

    (三)材料

          (1) 新鲜牡蛎。 

          (2) 新鲜兔肝。

三、实验程序

  （一）操作方法

     1.牡蛎碱性磷酸酶的分离提取

   (1)称取100g牡蛎（蒸馏水洗净），加入150预先冷却的0.01mol/L Tris.HCL 缓冲液（PH7.5，含0.1mol/L NaCl），于高速组织捣碎机匀浆1min，量匀浆体积，于冰箱4℃放置3h进行抽取。（留匀浆液10ml，采用离心或过滤，得到上清液，待测酶的比活力）

   (2)缓慢加入20%（V/V）冰冷的正丁醇，边加边搅拌均匀。冰箱放置2~3h。

   (3)室温离心，4000r/min 30min，收集离心上清液，并量体积。。（留5ml上清液，对含0.1mol/L NaCl的0.01mol/L Tris.HCL 缓冲液PH7.5透析平衡，待测酶的比活力。）

   (4)在正丁醇处理的上清液中加入研磨细粉的固体硫酸铵至0.35饱和度（100ml加入20.9g）。缓慢加人，不断搅拌溶解，置冰箱静置4 h。

   (5) 室温离心，4 000 r/min 30 min，收集离心上清液，并量体积。（留5ml上清液，对0.01mol/L Tris.HCL 缓冲液PH7.5含0.1 mol/L NaCl透析平衡，待测酶的比活力）。

   (6) 0.35 mol/L饱和硫酸铵上清液，加入固体研磨细粉的硫酸铵至 0.70饱和度（100ml加入23.8g）。缓慢加入，不断搅拌溶解，置冰箱静置4 h。

   (7) 室温离心，4 000 r/min 30 min,收集沉淀物。（沉淀蛋白上浮，先把下面清液虹吸出来，余少量清液连同沉淀一起离心）

   (8) 得到沉淀物，溶于20mL 含 0.1 mol/LNaCl 的 0.01mol/L ris.HCL 缓冲液PH7.5。装入透析袋，先对预冷的0.5% NaCl透析(常换透析液），至无S〇4-2被检测出为止（可用一定浓度BaCl2溶液检验)。再对0.01 mol/L Tris . HCl pH7.5缓冲液透析平衡。 

   (9) 取出酶溶液，冷冻高速离心(0℃： 25 000 r/min 30 min)。

   (10) 离心上清液即为粗酶制剂，检测酶的比活力。装人棕色瓶于4℃冰箱保存。

 2.兔肝碱性磷酸酶的分离提取 

   (1) 取2 g新鲜免肝剪碎后，置于玻璃勻浆管中，加入0.01 mol/L醋酸镁，0.01 mol/L醋酸钠 6ml，研磨2?3 min。将匀浆倒入刻度离心管中，记录其体积。吸出0.1ml置于另一试管中，在此试管中加4.9ml PH8.8 Tris . HCl缓冲液稀释，待测比活力。

    (2) 加2 ml正丁醇于匀浆中，用玻璃棒充分搅拌2 min左右，然后在室温中旋转20min。用滤纸过滤，滤液置于刻度离心管中。

    (3) 滤液中加入等体积的冷丙酮，立即混勻后离心（2 000 r/min)5min，弃去上清液。在沉淀中加入0. 5 mol/L醋酸镁4 mL，用玻璃充分搅拌使其溶解，记录溶液体积。吸取0.1ml。置于另一试管中，在此试管中加入PH8.8 Tris . HCl缓冲液4.9ml，待测比活力。

   (4) 在溶液中缓慢加人冷95%乙醇，使乙醇zui终浓度达30%，混勻后离心（2000r/min）5min， 将上清液倒人另一离心管中，弃去沉淀。上清液中加人冷95%乙醇，使乙醇zui终浓度高达60%，混匀后离心(2 500 r/min)5 min，弃去上清液，沉淀中加人0.5 mol/L醋酸镁3ml，使其充分溶解，并记录体积。吸取0.2 mL置于另一试管中，加入pH8.8 Tris . HCl缓冲液3.8ml，待测比活力。

  (5) 上述溶液中逐渐滴加人冷丙酮。使丙酮zui终浓度达33%。混匀后离心（2000 r/min)5 min，弃去沉淀,上清液则在另一刻度离心管中再缓慢加入冷丙酮。使丙酮zui终浓度达50%。混匀后离心（(4000 r/min)10 min,，弃去上清液，沉淀即为部份纯化的碱性磷酸酶。此沉淀中加入pH8.8 Tris . HCl缓冲液4ml使其溶解，并记录体积，吸取0. 5 mL置于另一试管中，加入pH8.8 Tris . HCl缓冲液2 mL稀释，待测比活力。

 3.比活力测定 

   (1)对硝基苯酚标准曲线的制作：取15支试管编号，0号一支，1~7号各二支，按表10-1操作：

以对硝基苯酚的量（µmol/L）为横坐标，OD405值为纵坐标，绘制标准曲线。示出pNP的克分子消光系数（ε）值。

 (2) 酶活力的测定:

      取干净的试管21支，编号,0号一支作为空白对照，以缓冲液代替酶液;1~4号各3支，作为各步的酶样测定;1'?4'各2支，作为相应的样品对照;各管加入1.98ml底物溶液（试剂9）,于37℃恒温水浴中预热5 min, 1?4号管分别加人各步酶样20µl，反应10min，各管加入2 mL 0.1 mol/L NaOH终止反应并显色，0号加入20µl Tris . HCl缓冲液代替酶液，1'?4'管先加入NaOH后再分别补加对应的酶液20 µl 。以0号管调零点，于722分光光度计测定各管的OD405值，各个测定管的平均OD值减去对照管的平均OD值，从对照标准曲线求出产物的µmol数，算出酶活力。

（3）蛋白浓度的测定:

      上述分离提取的四步酶制剂按一定比例用Tris . HCl缓冲液稀释，稀释倍数视溶液的蛋白浓度高低而定，以1步骤所提的碱性磷酸酶为例，一般*步和第四步稀释40?50倍，第二步稀释5?10倍。第三步稀释2?5倍。 

取千净的试管13支，编号，0号一支作为空白试验，加入0.5 mLTris . HCl缓冲液稀释PH7.5；1~4号管各3支，作为各步的酶样测定，各管加人相应的已稀释的酶液0.5 mL;各管加入Folin-酚试剂甲 4 mL，室温放置10 min，再加入Folin-酚试剂乙0.5 mL，混勻，放置30 min。以0号管调零点，于 722分光光度计测定各管的OD650值，从对照标准曲线求出各样品的蛋白浓度。

 4.结果处理 

  计算：

式中：为透析后的体积变化系数；B为稀释倍数，C为由标准曲线査得的pNP（mol/L），t为反应时间，D为由标准曲线査得的蛋白的质量(mg)，V1为测定酶活力所用的酶量（ml）。